實(shí)驗(yàn)解析：ELISA操作步步驟大全

　　酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)材料，試劑，溶液

　　1.酶標(biāo)板，100μltip頭，1ml Ep管，濕盒

　　2.包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉buffer,pH 9.6)

　　碳酸鈉0.15g,碳酸氫鈉0.29g,疊氮鈉0.02g,加雙蒸水至100ml,調(diào)至pH 9.6

　　3. 封閉液(5%小牛血清/PBS溶液)

　　小牛血清5ml, 1*PBS(pH 7.4)95ml

　　4. 洗滌液(PBST, pH 7.4)

　　NaCl 0.8g, KH2PO40.02g,Na2HPO4.12H2O 0.29g, KCl 0.02g,Tween20 0.05ml,疊氮鈉0.01g,加雙蒸水至100ml,調(diào)至pH 7.4

　　5. 樣本稀釋液(PBS, pH 7.4)

　　NaCl 0.8g, KH2PO40.02g,Na2HPO4.12H2O 0.29g, KCl 0.02g,疊氮鈉0.01g,加雙蒸水至100ml,調(diào)至pH 7.4

　　6. 酶標(biāo)第2抗體(羊抗兔)稀釋范圍1:5,000-1:100,000

　　7. 底物液(TMB-過氧化氫尿素溶液)

　?、?底物液A:TMB20mg,無水乙醇10ml,加雙蒸水至100ml.

　　②底物液B(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液, pH 5.0-5.4)

　　Na2HPO41.46g, 檸檬酸0.933g, 0.75%過氧化氫尿素0.64ml, 加三蒸水至100ml,調(diào)至pH 5.0-5.4

　?、鄣孜顰和B按1:1混合即成TMB-過氧化氫尿素溶液.

　　8. 終止液(2mol/LH2SO4溶液)雙蒸水200ml,濃硫酸34ml,(緩慢滴加并不斷攪拌),加雙蒸水至300ml

　　9. 0.9%生理鹽水

　　Elisa試劑盒操作步驟:

　　1. 包被過程(注意設(shè)置空白對(duì)照,陰性對(duì)照):

　　將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度(一般所需抗原包被量為每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體.(為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋或?qū)迤椒旁诘撞坑袧窦啿嫉慕饘贊窈兄?

　　2. 封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔:

　　5%小牛血清置37℃封閉40min.封閉時(shí)將封閉液加滿各反應(yīng)孔,并去除各孔中的氣泡,封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

　　洗滌方法:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,將洗滌液注滿板孔,放置2min略作搖動(dòng),吸干孔內(nèi)液,傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌次數(shù)3次

　　3. 加入待檢測(cè)樣品(建立合適的濃度梯度):

　　檢測(cè)時(shí)一般采用1:50-1:400的稀釋度, 應(yīng)采用較大稀釋體積進(jìn)行,一般保證樣品吸取量>20μl.

　　將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中,每樣品至少加雙孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

　　4. 加入酶標(biāo)抗體:

　　酶標(biāo)抗體: 根據(jù)酶結(jié)合物提供商提供的參考工作稀釋度進(jìn)行. 37℃,30-60min之間.短于30min往往結(jié)果不穩(wěn)定.每孔加100μl.洗滌同前。

　　5. 加入底物液(現(xiàn)用現(xiàn)配):

　　選TMB-過氧化氫尿素溶液,OPD-過氧化氫底物液系統(tǒng)次之.

　　底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分鐘,加入終止液顯色.

　　6. 終止反應(yīng):

　　每孔加入終止液50μl終止反應(yīng),于20min內(nèi)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

　　7. 結(jié)果判斷:

　　OPD顯色后采用492nm波長(zhǎng),TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)需要450nm波長(zhǎng).檢測(cè)時(shí)一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零.用測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測(cè)定孔平均值的比值(P/N)表示,當(dāng)P/N大于2時(shí)作為抗體的效價(jià).(數(shù)值的大小依具體檢測(cè)要求而定.)

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