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PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2022-06-30    點(diǎn)擊次數(shù):1242

  PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)


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  PCR實(shí)驗(yàn)要注意以下幾點(diǎn):

  1. PCR引物設(shè)計(jì):

  引物設(shè)計(jì)可能是PCR擴(kuò)增成功zui關(guān)鍵的因素。如引物設(shè)計(jì)欠佳,可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足,甚至擴(kuò)增失敗,其原因是設(shè)計(jì)欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和/或形成引物二聚體,此又成為PCR反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)物,從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。

  在引物設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素,其中zui重要的是引物長(zhǎng)度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補(bǔ)問題、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。

  (1)引物長(zhǎng)度:由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時(shí)間均至少部分與PCR引物長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián),因此引物長(zhǎng)度是PCR擴(kuò)增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長(zhǎng)度為15-30核苷酸。

  (2)溶解溫度(Tm):因加熱而斷開H鍵,使雙鏈DNA分開或“溶解"為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計(jì)算:Tm=2(A+T) + 4(G+C)。

  需注意PCR反應(yīng)至少有兩個(gè)(一對(duì))引物,兩個(gè)寡核苷酸引物Tm 值應(yīng)比較接近,不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時(shí)可發(fā)生錯(cuò)配,而引物Tm值較低,反應(yīng)溫度較高時(shí)則可能不能發(fā)生作用,因此如引物的Tm值差異較大,可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增失敗。

  (3)引物序列互補(bǔ):設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)沒有3個(gè)堿基以上的內(nèi)引物配對(duì),如引物有這樣具有自我配對(duì)的區(qū)域,“彈回"即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時(shí)。

  (4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸:待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布,G+C含量平均-避免長(zhǎng)A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。在選擇的引物序列中應(yīng)沒有多G 或多C延伸,因其可促進(jìn)非特異性退火,多A 和多T延伸也應(yīng)避免,因其可“呼吸"和使引物-模板復(fù)合物展開延伸,降低擴(kuò)增的效率。同時(shí)多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應(yīng)被避免。

  (5)3’-末端序列:為控制引物錯(cuò)配,應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3’末端的位置。

  總而言之,應(yīng)重視PCR引物設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)應(yīng)認(rèn)真小心。對(duì)于一個(gè)成功的PCR來說,幾個(gè)重要因素如引物長(zhǎng)度、GC含量和3’序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基,因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時(shí),應(yīng)考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的傾向,不自我互補(bǔ),與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設(shè)計(jì),節(jié)省時(shí)間,減少錯(cuò)誤,可應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序優(yōu)化設(shè)計(jì)、選擇、確定寡核苷酸引物。

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